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葡聚糖凝胶分离的步骤方法
发布时间:2019-04-11 点击次数:31次
  葡聚糖凝胶分离适用于天然产物在有机溶剂中的纯化。例如:类固醇、萜类、脂类以及小分子多肽等,葡聚糖凝胶同时适用于分子类别非常相似的物质的分离和工业规模的制备,既可用于初步纯化步骤,也可以用于zui终精制步骤。
  葡聚糖凝胶分离方法:
  1. 乙醇浸泡:在室温下,将干粉浸泡于50-60%乙醇中至少24小时,并不断搅拌以保证凝胶溶胀,用无盐水洗去残存的乙醇滤干;
  2. 无盐水浸泡:室温下,在无盐水中充分溶胀24小时,间隙搅拌,以保证凝胶的完全溶胀,然后;
  3. 盐酸浸泡:在常温下再用0.2N HCl浸泡12小时,间隙搅拌,滤干,水洗只中性;
  4. 将溶胀好的凝胶脱气后(真空抽滤或超声波)根据装柱要求一次性置入柱内,注意保持湿态装柱,并避免柱内产生气泡或断层;
  5. 上样前平衡层析柱至少3-5 个柱体积直到记录仪基线变得平稳为止(流出液的PH值等于上柱的Buffer 的PH值);
  6. 凝胶过滤的上样量一般为5%的柱床体积,我们建议初次上样控制在1-2%的床体积,视分离情况可以调整;脱盐时上样量可以达到20% 的柱床体积,柱高的选择也与分离要求相关,柱高控制在40-50cm以下,过高的凝胶层会引起较大的反压,应当尽可能避免。难分离物质要有一定柱高和流速控制,脱盐时高径比为5:1 即可;
  7. 洗脱方法:可以用无盐水,也可以采用上柱时的缓冲液洗脱;在上柱Buffer 中加入NaCl等梯度洗脱或盐梯度洗脱也可以完全让葡聚糖凝胶分离纯化;
  8. 在位清洗(CIP)凝胶使用十次后作一次CIP,目的是去除柱床内沉淀的及顽固残留的蛋白。方法是以40cm/h 用1M 氢氧化钠反向洗四个柱体积,再以至少三个柱体积平衡缓冲液再生。
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